Ausrüstung

Fluoreszenzmikroskop Aufbau: Schneewittchen

Das Nikon Ecplipse TI: HUBC/A invertierte Mikroskop ist sowohl für Hellfeldmikroskopie als auch für Fluoreszenzmikroskopie. Der Aufbau und seine Atmosphäre können temperiert warden. Die Temperatur wird durch ein okolab Thermostat geregelt, sodas eine präzise Einstellung bis 50 °C ermöglicht wird. Luftfeuchtigkeit als auch Schutzgasatmosphäre können ebenfalls kontrolliert werden.

Verschiedene Probenhalter in Kombination mit mehreren Objektiven ermöglichen die Analyse einer weitreichenden Anzahl an Proben.

Zur Fluoreszenzanregung können verschiedene Laser genutzt werden:

405 nm: Toptica iBeam smart 405S-HP 300 mW
488 nm: Toptica iBeam smart 488S-HP 200 mW
561 nm: Cobolt Jive TEM 500 mW
640 nm: 2x Toptica iBeam smart 640 CD 200 mW mit unterschiedlicher Polarisation

Die Hellfeldmikroskopie wird durch eine im Mikroskop eingebaute LED ermöglicht. Eine Verstärkung der Laserintensität wird durch LEDs einer lumencor Spectra III Lichtmaschine geboten:

390/22 nm mit 500 mW
440/20 nm mit 500 mW
475/28 nm mit 500 mW
510/25 nm mit 400 mW
555/28 nm mit 500 mW
575/25 nm mit 500 mW
635/22 nm mit 500 mW
747/11 nm mit 500 mW

Eine Sammlung verschiedener Objektive bietet für viele Messanforderung die richtige Auswahl:

Olympus UPlanSApo 60x/1.20 Wasser
Nikon S Plan Fluor ELWD 40x/0.60
Nikon HP Plan Apo VC 100x/1.40 Öl
Nikon Apo TIRF 100x/1.49 Öl

Der Aufbau enthält eine Yokogawa CSU-X1FW spinning disk Einheit mit einer Rotationsfrequenz bis zu 5000 rpm. Ein Strahlenteiler Di01-T405/488/568/647 quad-band dichroitischer Spiegel incl. verscheidener optischer Filter decken einen großen Bereich des sichtbaren Spektrums ab um Konfokalmikroskopietechniken anzuwenden. Weitere Filter, die in der spinning disk Einheit verwendet werden um den Hintergrund zu reduzieren sind:

Chroma ET 455/50m Bandpass
Chroma ET 525/50m Bandpass
Chroma ET 605/70m Bandpass
Chroma ET 685/70m Bandpass
Chroma ET 700/75m Bandpass
Semrock 617/73 Brightline HC Bandpass

Für superauflösende Fluoreszenzmikroskopie-Techniken ist ein „Double Helix Optics“ Spindle Modul^[1] verbaut, welches das Fluoreszenzbild modifiziert, sodass Informationen der 3. räumlichen Dimension extrahiert werden können. Phasenmasken für eine Emissionswellenlänge von 580 nm als auch 670 nm sind verfügbar. Dieser 2. Emissionspfad wird mit einer Photometrics Prime 95B CMOS Kamera (1,44 MP, 41 FPS 16bit, 80 FPS 12bit) detektiert. So können Bilder mit einer Auflösung weit unter dem Diffraktionslimit generiert werden. So ist es möglich zerstörungsfreie Mikroskopiemethoden anzuwenden, mit denen eine räumliche Auflösung unter 50 nm in allen 3 räumlichen Dimensionen und sogar unter 25 nm in der Fokusebene (xy-Ebene) möglich sind.^[2]

Literatur

[1] S. R. Pavani, R. Piestun, Opt Express 2008, 16, 3484-3489.

[2] G. Grover, S. Quirin, C. Fiedler, R. Piestun, Biomed Opt Express 2011, 2, 3010-3020.

Olympus IX83 invertiertes Fluoreszenzmikroskop: „Hänsel“

An diesem Setup stehen sowohl Weitfeld- (Köhler) und TIRF- Beleuchtung, als auch ein konfokaler Zweig zur Verfügung. Die Probe kann auf ein Deckglas aufgebracht, oder in einen Flüssigkeits-Probenhalter eingefüllt werden und kann mit einem xyz-Piezo Tisch (P-545.3R7, Physik Instrumente) bewegt werden. Wir verfügen über verschiedene Aufbauten zum Heizen und Kühlen der Probe für einen Bereich zwischen 8 °C und 200 °C (ITO Deckgläser). Darüber hinaus kann mit einer Feuchtekammer die Luftfeuchtigkeit eingestellt werden.

Die folgenden Objektive können benutzt werden

Olympus 60XO UPLSAPO (NA:1.35; WD: 0.15 mm) Öl

Olympus 100XO2 UPFLN (NA:1.3; WD: 0.2 mm) Öl

Olympus 60XW UPLSAPO (NA1.2; WD: 0.28 mm) Wasser

Olympus 100XO UApoN (TIRF) (NA: 1.49) Öl

Im Filterrad stehen verschiedene Filter zur Verfügung

Pos 1: DC: ZT 458 RDC (Chroma)

Pos2: DC: ZT 488 RDC (Chroma)

Pos3: DC: HC BS R514 (Semrock)

Pos4: DC: "Triple Line" (ZT 405/561/657rpc-UF1 dichroic) (Chroma)

Pos5: DC: "TIRF Quad-Line" (ZT 405/488/561/640rpc) (Chroma)

Pos6: DC: ZT 405/488/532/640 (Chroma)

Pos7: DC: ZT 561 (Chroma)

Es kann aus verschiedenen Emissionsfiltern ausgewählt werden. Die am häufigsten verwendeten sind:

ET 510 LP (Chroma)

ET 685/70 M (Chroma)

ET 500 LP (Chroma)

617/73 BrightLine HC (Semrock)

ZET405/473/532/640m (Chroma)

Zur Anregung können die folgenden Laser verwendet werden

378 nm Diodenlaser (i beam smart 375-S Toptica, 70 mW)

488 nm ultra-kompakter Diodenlaser (Cobolt MLD, 200 mW)

532 nm (Laser World, 500 mW)

561 nm diodengepumpter Festkörperlaser (Cobolt Jive, 200 mW)

638 nm ultra-kompakter Diodenlaser (Cobolt MLD, 150 mW)

Argonlaser (American Laser Corporation)

Detektionspfad

Das Emissions-Signal kann mittels eines Optosplit II bypass (CAIRN Research) in Wellenlänge oder Polarisation aufgeteilt werden. Derzeit ist in das Gerät ein ZT 594 RDC dichroitischer Spiegel (AHF Analysentechnik) eingebaut, um das emittierte Licht in zwei Kanäle (<594 nm und >594 nm) aufzuspalten. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, weitere Emissionsfilter einzubauen.

Bevor die Signale den Chip der EMCCD Kamera erreichen, passieren sie eine zylindrische Linse (Brennweite 500 mm). Dadurch wird ein Astigmatismus erzeugt, sodass die z-Position der Emitter bestimmt werden kann.^[1]

Das Licht der beiden Optosplit Kanäle wird von einer EMCCD Kamera (512x512 Pixel; Andor IXon 897) auf zwei verschiedenen Bereichen des Chips detektiert. Die resultierende Pixelgröße, nach der Vergrößerung durch das Setup, ist üblicherweise 80 nm pro Pixel.

Mit diesem Setup ist es möglich, superauflösende Fluoreszenzmikroskopietechniken anzuwenden. Darüber hinaus kann mithilfe des Optosplit Moduls das emittierte Licht in seiner Wellenlänge auf zwei verschiedene Kanäle aufgeteilt und auf zwei unterschiedlichen Bereichen des EMCCD Chips abgebildet werden. Durch Verwendung des solvatochromen Farbstoffs Nilrot visualisierten Purohit et al. damit die Polarität von Mikrogelen mit nanoskopischer Auflösung.^[2]

Literatur
[1] B. Huang, W. Wang, M. Bates, X. Zhuang, Science 2008, 319, 810.

[2] A. Purohit, S. P. Centeno, S. K. Wypysek, W. Richtering, D. Wöll, Chemical Science 2019, 10, 10336-10342.